پلاسمید

وکتورها، پلازمیدهایی هستند که در مهندسی ژنتیک از آن‌ها استفاده می‌شود. از پلازمیدها در مهندسی ژنتیک برای تکثیر یا بیان ژن یا ژن‌های خاصی استفاده می‌شود. برای این کار، ژن مورد نظر را وارد پلازمید می‌کنند. این نوع از پلازمیدها به‌طور معمول دارای یک ژن مقاومت آنتی‌بیوتیکی (برای غربالگری) و یک جایگاه کلونینگ چندگانه (به انگلیسی: multiple cloning site) یا polylinker است. جایگاه کلونینگ چندگانه، قطعه کوچکی از پلازمید است که دارای چند جایگاه برش برای آنزیم‌های محدود الاثر مختلف (به انگلیسی: restriction enzymes) است. این کار سبب می‌شود که قطعه یا ژن دلخواه به راحتی وارد پلازمید شود. در مرحله بعد، پلازمید از طریق ترانسفورماسیون وارد باکتری می‌شود. سپس باکتری در معرض یک آنتی‌بیوتیک خاص قرار می‌گیرد. باکتری‌هایی که پلازمید مورد نظر را داشته باشند، زنده می‌مانند زیرا ژن مقاومت آنتی‌بیوتیکی را بر روی پلازمید مورد نظر حمل می‌کنند اما باکتری‌هایی که پلازمید را نداشته باشند، می‌میرند. با استفاده از این روش (غربالگری با آنتی‌بیوتیک) می‌توان باکتری‌های دارای پلازمید را جدا ساخت و آن‌ها را به میزان زیاد تکثیر داد. سپس پلازمیدها را به میزان زیاد از آن‌ها جدا ساخت. ظرفیت پذیرش قطعات DNA در پلازمیدها بین ۱ تا ۱۰ کیلو جفت باز است. برای کلون کردن قطعات یا ژن‌های بزرگتر بایستی از فاژ لامبدا، کاسمیدها (به انگلیسی: cosmids)، کروموزوم‌های مصنوعی باکتریایی (به انگلیسی: bacterial artificial chromosomes) یا کروموزوم‌های مصنوعی مخمری (به انگلیسی: yeast artificial chromosomes) استفاده کرد.

مدل‌های بیماری

دانشمندان از دیرباز با استفاده از پلازمیدها، سلول‌های بنیادی جنینی موش‌ها را تغییر می‌دادند تا بیماری‌های ژنتیکی را مدل‌سازی کنند. البته این امر با محدودیت‌هایی روبرو بود که کاربرد گسترده‌تر آن در انسان را با چالش روبرو می‌ساخت. با این حال، پیشرفت در زمینه تکنیک‌های نوترکیبی در ویروس‌های مرتبط با آدنو (به انگلیسی: Adeno-associated virus) و نوکلئازهای انگشت روی (به انگلیسی: Zinc finger nucleases) در ایجاد مدل‌های بیماری‌های ژنتیکی انسانی بسیار مؤثر بوده‌اند.

ژن درمانی

موفقیت ژن درمانی بستگی به داخل‌سازی ژن دلخواه به درون کروموزوم انسان بدون ایجاد آسیب به سلول، ایجاد جهش‌های سرطان زا یا پاسخ ایمنی داشته‌است. استفاده از وکتورهای پلازمیدی، یکی از روش‌های ژن درمانی است. استفاده از نوکلئازهای انگشت روی (به انگلیسی: Zinc finger nucleases) موجب نوترکیبی هومولوگ در جایگاه خاصی از کروموزوم می‌شود. از این طریق می‌توان ژن دلخواه را وارد سلول‌های انسانی کرد.

اپی زوم‌ها معادل یوکاریوتی پلاسمیدهای باکتریایی هستند. در یوکاریوت‌ها به‌طور معمول اپی زوم‌ها، DNAهای حلقوی بسته‌ای هستند که داخل هسته تکثیر پیدا می‌کنند مانند آدنوویروس‌ها، هرپس ویروس‌ها و پولیوماویروس‌ها. برخی از اپی زوم‌های ویروسی در سیتوپلاسم تکثیر پیدا می‌کنند مانند پوکس ویروس‌ها. برخی از اپی زوم‌ها مانند هرپس ویروس‌ها از مکانیسم دایره غلتان (به انگلیسی: rolling circle) برای تکثیر خود استفاده می‌کنند مانند آنچه که در مورد فاژهای باکتریایی اتفاق می‌افتد. برخی از آن‌ها از طریق مکانیسم همانندسازی دو جهته (به انگلیسی: bidirectional replication mechanism) تکثیر پیدا می‌کنند (پلاسمیدهای نوع تتا). در هر دو مورد، اپی زوم‌ها به‌طور فیزیکی مجزا از کروموزوم میزبان هستند.

یکی از روش‌های طبقه‌بندی پلازمیدها بر اساس انتقال آن‌ها به دیگر باکتری‌هاست. پلازمیدهای هم یوغی (به انگلیسی: Conjugative plasmids) دارای ژن‌های tra می‌باشند که در فرایند هم یوغی (هم یوغی) نقش دارد. در هم یوغی، پلازمید از یک باکتری به باکتری دیگر منتقل می‌شود. پلازمیدهای غیر هم یوغی توانایی آغاز هم یوغی در باکتری‌ها را ندارند اما می‌توانند با کمک پلازمیدهای هم یوغی منتقل شوند. انواع مختلفی از پلازمیدها ممکن است در یک سلول وجود داشته باشد. با این حال، پلازمیدهای مشابه یا هم خانواده اغلب اوقات ناسازگار (به انگلیسی: incompatible) هستند به‌طوری‌که فقط یکی از آن‌ها در سلول باقی خواهد ماند. این امر به دلیل تنظیم عملکردهای حیاتی آن‌ها اتفاق می‌افتد. پس بنابراین می‌توان پلازمیدها را در گروه‌های ناسازگاری مختلف طبقه‌بندی کرد.

روش دیگر طبقه‌بندی پلازمیدها بر اساس عملکرد آن هاست:

• پلازمیدهای F یا پلاسمیدهای باروری (به انگلیسی: Fertility) که دارای ژن‌های tra هستند. آن‌ها موجب بیان پیلی جنسی و هم یوغی در باکتری‌ها می‌شوند.
• پلازمیدهای R یا پلاسمیدهای مقاومت که ژن‌های مقاومت نسبت به آنتی‌بیوتیک‌ها یا ژن‌های توکسین‌ها (سموم) را حمل می‌کنند.
• پلازمیدهای Col که ژن‌های کدکننده باکتریوسین‌ها را حمل می‌کنند. باکتریوسین‌ها، پروتئین‌هایی هستند که می‌توانند سایر باکتری‌ها را از بین ببرند.
• پلازمیدهای تجزیه‌کننده (به انگلیسی: Degradative plasmids) که این توانایی را به باکتری می‌دهند تا ترکیبات غیرمعمول را تجزیه کنند مانند تولوئن و اسید سالیسیلیک.
• پلازمیدهای بیماریزایی (به انگلیسی: Virulence plasmids) که موجب تبدیل یک باکتری غیر بیماری زا به یک باکتری بیماری زا (پاتوژن) می‌شوند.

پلازمیدها، عناصری ژنتیکی هستند که ضرورتی چندانی برای سلول ندارند و تنها برخی ویژگی‌ها را به باکتری‌ها می‌دهند که به بقای آن‌ها کمک می‌کند. در صورتی‌که پلازمیدهای سلول حذف شوند، سلول می‌تواند به زندگی خود ادامه دهد. همچنین همانند سازی پلازمیدها ارتباطی با چرخه سلولی و تقسیم سلولی ندارد. آن‌ها می‌توانند مستقل از چرخه سلولی به تعداد نامحدود (تعداد را نیاز سلول و شرایط محیطی تعیین می‌کند) تکثیر شوند. در هر سلول ممکن است چندین پلازمید مشابه وجود داشته باشد. با این وجود، کروموزوم‌ها بسیار برای سلول حیاتی هستند و درصورت حذف هر یک از کروموزوم‌ها، سلول خواهد مرد. تعداد دقیق کروموزوم‌ها، بسیار برای تعادل ژنتیکی سلول ضروری است. حتی اگر یکی از کروموزوم‌های همولوگ حذف شوند، این تعادل بهم خواهد خورد. همانندسازی کروموزوم‌ها دقیقاً منطبق با چرخه سلولی است و در هر چرخه سلولی فقط یک بار همانندسازی می‌کنند.

دو نوع وکتور مهم پلازمیدی در مخمرها عبارتند از YIp و YRp.

YIp، پلازمید الحاقی مخمری (به انگلیسی: Yeast integrative plasmid) است که برای زنده ماندن و تکثیر وارد کروموزوم مخمر می‌شود. YRp، پلازمید همانندساز مخمری (به انگلیسی: Yeast Replicative plasmid) است که پایداری کمتری دارد و در هنگام جوانه زدن مخمر ممکن است از دست برود.

پلازمید در اثر عفونت با باکتری آگروباکتریوم وارد گیاه می‌شود. امروزه از این‌گونه پلازمیدها، پس از انجام تغییراتی بر روی آنها، برای انجام مهندسی ژنتیک در گیاهان، استفاده می‌شود.

بیشتر باکتری‌های دارای پلازمیدهایی می‌باشند که به آن‌ها ویژگی‌های تازه‌ای مانند مقاومت به یک آنتی‌بیوتیک خاص، مصرف نوعی قند یا اسید آمینه، تولید رنگدانه، بیماریزایی، تجزیه هیدروکربن‌ها یا مولکول‌های پیچیده شیمیایی و غیره می‌دهد.

• وکتور