توالی‌یابی

توالی دی‌ان‌ای، فرایند تعیین ترتیب نوکلئوتیدها در یک قطعه دی‌ان‌ای است. برای انجام توالی‌یابی، معمولاً از روش توالی‌یابی به روش سنگر ابداع‌شده توسط فردریک سنگر، استفاده می‌شود. در این تکنیک از لایه‌های نوکئوتیدی اصلاح‌شده به کمک خاتمهٔ توالی خاص، بهره گرفته شده‌است. البته روش‌های جدید دیگری همانند تکنیک تعیین توالی به‌وسیله پیروفسفات نیز مورد استفاده قرار گرفته‌است. درحال حاضر به کمک روش پیروفسفات، داده‌های زیادی تولید شده‌است که در دسترس قرار دارند. در یک‌بار اجرای این روش، ژنوم یک باکتری توالی‌یابی می‌شود. همچنین اخیراً ژنوم جیمز واتسون به کمک این روش، توالی‌یابی شده‌است. توالی دی‌ان‌ای، اطلاعات مهم و ضروری برای ادامهٔ زندگی و تولیدمثل جانداران را رمز می‌کند؛ بنابراین توالی‌یابی دی‌ان‌ای جانداران، برای پی بردن به چرایی و چگونگی برخی اتفاقات در زندگی یک موجود زنده و تولید مثل آن بسیار حائز اهمیت و مورد استفاده‌است. به کمک اطلاعات استخراج‌شده از دی‌ان‌ای، بسیاری از بیماری‌های ژنتیکی تشخیص داده و به درمان آن نیز کمک می‌کند. همچنین تحقیق و مطالعهٔ عوامل بیماری‌زا نیز در درمان بیماری‌های واگیردار مؤثر است. علم بیوتکنولوژی، به این مسائل می‌پردازد. کارلسون پیش‌بینی کرد سرعت دو برابر شدن فناوری توالی‌یابی، حداقل به اندازهٔ قانون مور خواهد بود. منحنی کارلسون کاهش هزینه و افزایش کارایی با سرعت زیاد را در تکنیک‌های توالی‌یابی نشان می‌دهد.

روش فردریک سنجر (خاتمهٔ زنجیره)

اساس این تکنیک استفاده از آنالوگ‌های شیمیایی نوکلئوتیدی بود که فاقد گروه OH بر روی کربن ′۳ خود برای گسترش زنجیرهٔ دی‌ان‌ای هستند و نمی‌توانند با ′۵ فسفات بعدی خود واکنش دهند؛ بنابراین هنگامی که در زنجیرهٔ در حال تکثیر اسید نوکلئیک قرار گیرند واکنش، متوقف خواهد شد. ترکیب ddNTPها همراه با غلظت‌های مشخص از dNTP استاندارد در واکنش سنتز دی‌ان‌ای منجر به تولید رشته‌های دی‌ان‌ای با طول‌های مختلف می‌شود (تولید رشته‌هایی که تنها در یک نوکلئوتید تفاوت طول دارند). این تکنیک نیازمند دی‌ان‌ای تک‌رشته‌ای به‌عنوان الگو است که با استفاده از فاژمیدها حاصل می‌شود. دی‌ان‌ای تک‌رشته‌ای به همراه سایر مواد مورد نیاز سنتز دی‌ان‌ای به چهار لوله آزمایش که هر کدام حاوی یک نوع باز ddNTP است انتقال داده می‌شود. ddNTPها به‌طور تصادفی توسط آنزیم دی‌ان‌ای پلیمراز به رشتهٔ در حال ساخت افزوده می‌شوند. نهایتاً در هر لوله آزمایش قطعاتی با طول مختلف تولید می‌شود. قطعات تولیدشده بر روی ژل پلی‌اکریل‌آمید اجرا می‌شوند و با استفاده از اتورادیوگراف بر روی ژل ظاهر می‌شوند. دقت، قدرت و آسانی در روش خاتمهٔ زنجیره یا توالی‌یابی سنگر باعث شد این تکنیک برای سال‌های متمادی مورد استفاده قرار گیرد.

آران‌ای‌ها در سلول‌ها ناپایدارتر هستند و همچنین در برابر آنزیم‌های نوکلئاز که در آزمایش‌ها استفاده می‌شوند، آسیب‌پذیرتر هستند. آران‌ای نتیجهٔ رونویسی دی‌ان‌ای است. هرچند کل اطلاعات ژنتیکی در دی‌ان‌ای وجود دارد ولی گاهی لازم است که آران‌ای هم توالی‌یابی شود.

روش‌های متنوعی برای توالی‌یابی پروتئین‌ها به‌کار گرفته می‌شود که عبارت‌اند از:

• Edman degradation
• شناسایی جرمی پپتیدها (به انگلیسی: Peptide mass fingerprinting)
• طیف‌سنجی جرمی
• هضم پروتئاز (به انگلیسی: Protease digests)

سایر کاربردهای توالی‌یابی شامل بررسی تعامل Long non-coding RNA و کروماتین، تعیین نواحی باز یا در دسترس یوکروماتین یا ChIRP-seq و نیز کاربرد در حوزهٔ متاژنومیکس است. متاژنومیکس شناسایی و مطالعهٔ ماده ژنتیکی میکروبی است که به‌طور مستقیم از نمونه‌های محیطی به‌دست آمده‌است. شناسایی جانداران موجود در یک محیط خاص برای تحقیقات بوم‌شناسی، بیماری‌شناسی و میکروب‌شناسی حیاتی است. توالی‌یابی به محققان این امکان را می‌دهد تا به‌عنوان مثال، انواع میکروب‌های موجود در یک میکروبیوم را شناسایی کنند.

1. ↑ Wheeler, David A.; Srinivasan, Maithreyan; Egholm, Michael; Shen, Yufeng; Chen, Lei; McGuire, Amy; He, Wen; Chen, Yi-Ju; Makhijani, Vinod (2008-04-17). "The complete genome of an individual by massively parallel DNA sequencing". Nature. 452 (7189): 872–876. doi:10.1038/nature06884. ISSN 1476-4687. PMID 18421352.
2. ↑ Carlson, Robert (2003). "The pace and proliferation of biological technologies". Biosecurity and Bioterrorism: Biodefense Strategy, Practice, and Science. 1 (3): 203–214. doi:10.1089/153871303769201851. ISSN 1538-7135. PMID 15040198.